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Protocolo do Ensaio de Investigação
Estudos científicos feitos com
GREEN SAP
Protocolo do Trabalho
Ensaios cinéticos de proliferação
celular.
Estes ensaios foram feitos em dois tipos de células:
1. Células tumorais: Línea Tumoral Linfóide
de Origem Murino BW5147 que expressa no alótipo H-2K,
CD3+ e o TCRaß, os quais são testados com freqüência
por citometria de fluxo usando anticorpos específicos
contra os correspondentes marcadores de superfície.
2. Linfócitos T normais, extraídos de ínguas
linfáticas de ratos das cepas BALG/c de três
a quatro meses de idade, obtidos em forma acéticas.
Os ensaios “In Vitro” são
realizados em condições de esterilidade em microplacas
de cultivo de 96 Wells em um volume final de 0,2 ml.
O efeito da proliferação celular da mistura
a ensaiar se medirá a diferentes tempos de cultivo
(24, 48, 72 y 96 hs.) e em ausência (controle) o presença
de diferentes concentrações da mistura com a
finalidade de determinar a cinética de ação
do produto. As concentrações a ensaiar serão
dissoluções seriadas ao meio em um lapso de
concentrações que inclui a dose proposta para
usos em humanos, desde 1/250 até 1/4000.
A proliferação celular será avaliada
por meio da técnica de incorporação de
Timidina Tritiada (20 Ci/mmol). Para isto os cultivos celulares
serão pulsados por um período de 16 horas no
casso de linfócitos normais e de 6 horas para a células
tumorais com Timidina Tritiada, após o qual os núcleos
celulares são retidos por filtrações
de papel de fibra de vidro, whatmann GF/A. A timidina radioativa
incorporada ao DNA será quantificada em contador liquido
Wallac.
A concentração de células a utilizar
será para a línea tumoral de 3 x 105 concentração
celular ótima final e para as células normais
2 x 106 celulas/mililitros.
Ambos tipos celulares serão cultivados
em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino
e 2 mM de glutamina e em presença dos antibióticos:
penicilina (100U/ml) e esptreptomicina (100µ/ml).
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